納米氧化鋅具有極強(qiáng)的抗氧化性、抗腐蝕性、光催化性和獨(dú)特的抗紫外線性，使其在光電學(xué)、橡膠工業(yè)、日用化工、食品添加劑、生物醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用廣泛。納米氧化鋅可通過皮膚、呼吸道或消化道進(jìn)入生物體并在體內(nèi)積蓄，但機(jī)體很難排除這類微小物質(zhì)，因此潛在一定的生物毒性效應(yīng)，對(duì)其生物安全性的研究已成為目前的研究熱點(diǎn)。
為了探討納米氧化鋅是否具有肝腎細(xì)胞毒性，本研究以人正常肝細(xì)胞HL-7702和人胚腎細(xì)胞HEK293為研究對(duì)象，首先通過形態(tài)學(xué)觀察、MTT(噻唑鹽)比色法來檢測(cè)納米氧化鋅對(duì)細(xì)胞活性的影響，然后通過單細(xì)胞凝膠電泳和微核試驗(yàn)檢測(cè)其誘導(dǎo)的單鏈DNA斷裂程度和染色體損傷程度。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(包括GSH、MDA和SOD水平)，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)羰基含量來探討納米氧化鋅對(duì)細(xì)胞的氧化損傷作用及可能機(jī)制。同時(shí)，利用DNA-laddering法來研究納米氧化鋅誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。一、納米氧化鋅對(duì)HL-7702及HEK293細(xì)胞的毒性作用研究通過透射電鏡確定納米氧化鋅粒子粒徑分布，制備成不同濃度的含氧化鋅培養(yǎng)液與人正常肝細(xì)胞HL-7702及人胚腎細(xì)胞HEK293接觸培養(yǎng)，通過倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，采取MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性，計(jì)算相對(duì)增值率(RGR)，并進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，高劑量納米氧化鋅粒子作用細(xì)胞對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響更為明顯，可導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞凋亡或壞死。MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)于HL-7702和HEK293細(xì)胞，當(dāng)納米氧化鋅粒子濃度分別達(dá)到10μg/mL和25μg/mL時(shí)，納米氧化鋅實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組組相比出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，并表現(xiàn)出濃度-效應(yīng)關(guān)系。
二、納米氧化鋅對(duì)HL-7702及HEK293細(xì)胞的遺傳毒性探討納米氧化鋅對(duì)人肝腎細(xì)胞的遺傳毒性效應(yīng)，采用不同濃度納米氧化鋅10、25、50、75和100μg/mL對(duì)分別對(duì)HL-7702和HEK293細(xì)胞進(jìn)行染毒12h，24h和48h后，用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的DNA的損傷程度。并采用微核試驗(yàn)檢測(cè)染毒后雙核細(xì)胞的微核發(fā)生率，以期得出納米氧化鋅體外遺傳毒性。結(jié)果顯示，納米氧化鋅染毒肝腎細(xì)胞后，隨著培養(yǎng)基中納米氧化鋅濃度的增加，與對(duì)照組相比，高劑量染毒組細(xì)胞頭部DNA含量(Head DNA%)顯著降低，尾部DNA含量(Tail DNA%)、尾矩(Tail Moment)、Olive尾矩(Olive Tail Moment)數(shù)值顯著升高(P＜0.05)；微核試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)染毒組的微核率顯著升高。研究結(jié)果提示，高濃度的納米氧化鋅可引起人肝胚腎細(xì)胞DNA和染色體水平損傷，表現(xiàn)出遺傳毒性效應(yīng)，認(rèn)為其對(duì)細(xì)胞DNA的損傷個(gè)的納米氧化鋅致體外細(xì)胞毒性的主要機(jī)制之一。
三、納米氧化鋅致HL-7702及HEK293細(xì)胞氧化損傷作用的研究驗(yàn)證納米氧化鋅是否致使HL-7702及HEK293細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷作用，采用不同濃度的納米氧化鋅10、25、50、75和100μg/mL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒處理，24h后收集細(xì)胞，檢測(cè)其谷胱甘肽GSH、丙二醛MDA和超氧化物歧化酶SOD水平，探討細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，并通過檢測(cè)蛋白質(zhì)羰基含量來反映納米材料對(duì)蛋白質(zhì)的氧化損傷作用。結(jié)果表明，在納米氧化鋅處于一定劑量范圍內(nèi)(≤100μg/mL)，納米氧化鋅處理組總SOD和GSH酶活力降低，而MDA含量增加，且呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，在高濃度納米氧化鋅組中蛋白質(zhì)羰基含量與對(duì)照組相比有顯著性的升高(P<0.05)。進(jìn)一步證實(shí)納米氧化鋅可對(duì)人肝腎細(xì)胞產(chǎn)生明顯氧化損傷作用，并認(rèn)為氧化損傷是納米氧化鋅導(dǎo)致細(xì)胞毒性的主要機(jī)制之一。
四、納米氧化鋅致HL-7702及HEK293細(xì)胞凋亡作用的研究采用DNA-ladder法探討納米氧化鋅對(duì)人肝腎細(xì)胞凋亡作用的影響，結(jié)果表明：納米氧化鋅處理細(xì)胞后進(jìn)行的DNA電泳圖顯示，DNA在100-200bp發(fā)生不同程度的特異性斷裂，出現(xiàn)較明顯的DNA ladder片段，提示納米氧化鋅能誘導(dǎo)人肝腎細(xì)胞發(fā)生凋亡作用。納米氧化鋅誘發(fā)的細(xì)胞凋亡可能是發(fā)生細(xì)胞毒性的機(jī)制之一，其有關(guān)機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。
